在開(kāi)始RT-PCR定量檢測之前，請閱讀關(guān)于PCR的實(shí)驗方案和操作建議。RNA的純度和完整性是合成全長(cháng)cDNA的關(guān)鍵。RNA的質(zhì)量受RNase A的影響，RNase A是一般實(shí)驗室環(huán)境中存在的非常穩定的污染物。因此，從事RNA研究時(shí)，需要時(shí)刻考慮到RNase污染的問(wèn)題。所有Thermo Scientific應用于逆轉錄反應的產(chǎn)品(包括酶、緩沖液、水、核苷酸和寡核苷酸)經(jīng)嚴格測試均不含RNase污染。 為防止污染這些高質(zhì)量的組分，實(shí)驗室環(huán)境和所有自制溶液也必須無(wú)RNase污染。
避免RNase污染的常規操作建議：
• 用DEPC處理所有在cDNA合成中將要使用的試管和槍頭，或使用經(jīng)過(guò)認證的無(wú)RNase的實(shí)驗室器具。
• 使用RNA工作的移液器。
• 操作RNA和所有試劑時(shí)需佩戴手套，因為皮膚是RNase的主要來(lái)源。經(jīng)常更換手套。
• 使用鑒定合格的試劑，包括高質(zhì)量的水(如DEPC-treated water)。
• 使用RNase抑制劑來(lái)穩定RNA，例如RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)。
• 進(jìn)行cDNA合成前，要求對RNA的完整性進(jìn)行鑒定。
• 例如，如果在總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳中，人的18S rRNA(分子量約1.9kb)和28S rRNA(分子量約為5kb)都形成了非常窄的條帶，則認為該樣品中的mRNA是完整無(wú)缺的。
RT反應混合物的組分
模板RNA
標準方法分離的細胞總RNA，可與Thermo Scientific逆轉錄酶或*鏈cDNA合成試劑盒一起成功使用。純化的RNA要求無(wú)鹽、金屬離子、乙醇和酚殘留，以避免在逆轉錄反應期間
產(chǎn)生抑制作用。另外，RT-PCR的模板RNA必需無(wú)DNA污染，以避免PCR或qPCR出現假陽(yáng)性結果。推薦使用DNase I，RNasefree(#EN0521)除去制備的RNA中痕量的DNA殘留。設置RT-PCR對照反應，對照組中模板是未經(jīng)逆轉錄的RNA。
從制備的RNA中除去基因組DNA：
1. 在RNase-free的試管中加入以下組分：
| RNA | 1-2 μg |
| 10x reaction buffer with MgCl2 | 1 μl |
| DNase I, RNase-free (#EN0521) | 1-2 μl (1-2 U) |
| DEPC-treated Water | to 9 μl |
| Total volume | 10 μl |
2. 37℃孵育30分鐘。
3. 加入1μl 50mM EDTA后，65℃孵育10分鐘。無(wú)螯合劑存在時(shí)加熱將促使RNA水解2?；蛘呤褂梅?氯仿抽提RNA。
4. 所制備的RNA可用作逆轉錄的模板。
備注：
• 每μg RNA，不要使用超過(guò)1U的DNase。
• 如果有大量RNA，可以將反應體系放大。
• 推薦的RNAzui終濃度為0.1-0.2 μg/μl。
• RiboLock RNase Inhibitor(#EO0381)也可以加入到反應體系中，抑制可能存在于起始RNA溶液中的RNase A。推薦使用濃度為1U/μl。
引物
oligo(dT)18、隨機引物或基因特異性引物均可用于*鏈cDNA的合成。Oligo(dT)18引物從真核mRNA 3’-末端的Poly(A)尾開(kāi)始合成cDNA。而隨機引物，如六聚體引物，可以從所有類(lèi)型RNA（rRNA和mRNA）開(kāi)始進(jìn)行cDNA合成。因此，使用隨機引物合成的cDNA比使用Oligo(dT)18引物合成的cDNA更加復雜，可能降低接下來(lái)PCR反應的靈敏度和/或特異性。然而，隨機引物可以?xún)?yōu)先應用于以下幾種情況：使用無(wú)poly(A)尾的真核生物mRNA進(jìn)行cDNA合成，或使用富含poly(A)的RNA模板進(jìn)行cDNA合成，以及進(jìn)行長(cháng)片段mRNAs 5’-區域的RT-PCR?；蛱禺愋砸餅閏DNA合成提供了zui高的特異性，引物由用戶(hù)自己制備。
逆轉錄酶
所有的Thermo Scientific 逆轉錄酶均適用于全長(cháng)*鏈cDNA合成，但逆轉錄酶在反應溫度、可轉錄的RNA量、靈敏度和RNase H活性方面有所不同。每種酶推薦使用的反應條件請
參見(jiàn)《使用RNA作為起始材料：用于RT-PCR和RT-qPCR的Thermo Scientific解決方案 》
*鏈cDNA的合成
下面列出了使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase進(jìn)行*鏈cDNA合成的實(shí)驗方案。使用其它種類(lèi)逆轉錄酶的相應反應條件，請參見(jiàn)第56頁(yè)的逆轉錄酶選擇表。Master Mix
為了準備多個(gè)平行實(shí)驗并zui大程度減少加樣誤差和污染，先將除了RNA和引物之外的所有反應組分預先混合制備RT master mix。制備足量的master mix(足夠用于所需反應并多配制一份以補償加樣誤差)。將模板RNA加入到各個(gè)試管中，并置于冰上。將所制備的master mix等分加入含有RNA的試管中。各組分自冷藏取出后，融化混勻并短暫離心，冰浴放置。
1. 按以下順序在無(wú)菌、nuclease-free的試管(冰浴放置)中加入以下組分：
| 模板 RNA | 總 RNA 或 poly(A) RNA 或特異性 RNA | 0.1 ng - 5 μg 10-500 ng 0.01 pg - 0.5 μg |
| 引物 | Oligo(dT)18 引物 (#SO131) 或隨機六聚體引物 (#SO142) 或基因特異性引物 | 0.5 μg (100 pmol) 0.2 μg (100 pmol) 15-20 pmol |
| DEPC-treated Water (#R0601) | to 12.5 μl | |
| 總體積 | 12.5 μl | |
2. 任選：如果RNA模板GC含量高，或含有二級結構，則需要輕輕混勻，短暫離心，65℃孵育5分鐘后在冰上急冷，短暫離心后冰浴放置。
3. 按順序添加下述組分，或制備master mix：
| 5x 反應緩沖液 | 4 μl |
| RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381) | 0.5 μl (20 U) |
| dNTP Mix, 10 mM each (#R0191) | 2 μl (1 mM終濃度) |
| RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (#EP0451) | 1 μl (200 U) |
| 總體積 | 20 μl |
4. 輕輕混勻并短暫離心。
5. 如果引物為 oligo(dT)18 或基因特異性引物，反應條件為42℃孵育60分鐘。如果使用隨機六聚體引物，則在25℃孵育10分鐘后，再在42℃孵育60分鐘。對于GC含量高的RNA的轉
錄實(shí)驗，可將反應溫度升高到45℃。
6. 反應液70℃加熱5分鐘以終止反應。
備注
• 逆轉錄產(chǎn)品可直接用于PCR中，或在-20℃下儲存。
• 在50μl PCR反應體系中，使用2μl 逆轉錄反應混合物。
qPCR優(yōu)化指南
| 優(yōu)化參數 | 建議 |
| qPCR 板 | 建議使用不透明的白色PCR板進(jìn)行qPCR檢測。這種白顏色實(shí)質(zhì)上消除了孔與孔之間的串聯(lián)干擾，并提高了熒光探測的效率，從而增加了定量檢測的靈敏度以及孔與孔之間的一致性。 |
| 模板質(zhì)量 | qPCR檢測中使用的核酸要求具有足夠的純度。模板污染(如基因組DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物或有機溶劑)會(huì )對定量檢測的可靠性和可重復性產(chǎn)生巨大影響。模板質(zhì)量必須通過(guò)分光光度儀(如Thermo Scientific Nanodrop)、微流體或PAGE進(jìn)行檢測。 |
| 擴增子長(cháng)度 | 擴增子長(cháng)度理想情況下，擴增子長(cháng)度應在100bp至150bp之間，以確保qPCR反應效率盡可能接近100%。好的qPCR效率可以促進(jìn)定量檢測的可重復性和靈敏度。對于特定試劑，遵守其使用說(shuō)明中關(guān)于擴增子長(cháng)度的要求。 |
| SYBR Green法 的引物設計 | 鑒于PCR引物是qPCR定量檢測中成本相對較低的一種組分，對于每一種新的qPCR定量檢測試劑，推薦訂購和測試至少兩對引物，增加建立可靠的、可重復的、靈敏的定量檢測方法的機會(huì )。 |
| 測試引物 | 使用SYBR Green法對一系列梯度稀釋的模板進(jìn)行檢測，以確認qPCR定量檢測方法的重復性、特異性、靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。理想情況下，qPCR反應的效率應高于90%，低于105%，而定量檢測的可重復性應高于r=0.998。 |
| 有效的RT | 實(shí)驗初始階段應根據供應商說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行逆轉錄實(shí)驗，但RT步驟的用時(shí)和溫度可以進(jìn)行相應優(yōu)化以提高逆轉錄酶的效率。應在一系列RNA濃度范圍上對逆轉錄酶進(jìn)行測試，以確保定量檢測的線(xiàn)性度。 |
| 熱啟動(dòng) | qPCR方案包括在95℃加熱的步驟，以確保熱啟動(dòng)DNA聚合酶被*激活。必須遵守試劑的使用說(shuō)明。加熱步驟時(shí)間太短會(huì )影響定量檢測的重復性和靈敏度。 |
| 循環(huán)方案 | 循環(huán)方案即便您曾經(jīng)使用其他供應商的混合試劑對您的定量檢測方法進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，我們仍然建議使用Thermo Scientific qPCR master mix使用指南中推薦的熱循環(huán)方案。如果需要進(jìn)行定量檢測方法優(yōu)化，應該首先檢查退火溫度。 |
| 退火溫度 | 測試一系列的退火溫度。根據qPCR結果，應以2-3℃為單位升高或降低退火溫度。此操作可通過(guò)設定thermal gradient在一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗中完成。也可以使用多個(gè)qPCR實(shí)驗來(lái)測試一系列的退火溫度。 |
| 引物濃度 | 一般使用在master mix中推薦的引物濃度來(lái)進(jìn)行qPCR反應。如果需要優(yōu)化，嘗試以25mM為單位升高或降低引物濃度。 |
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