MilliporeECL發(fā)光液哪些因素會(huì )影響信號的強弱呢？
瀏覽次數：1553發(fā)布日期：2022-04-21
MilliporeECL發(fā)光液以化學(xué)熒光發(fā)光方法檢測蛋白質(zhì)或核酸類(lèi)生物大分子。其原理是，蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉移到印跡膜上，以抗體及辣根過(guò)氧化物酶HRP標記的第二抗體結合膜上的目的蛋白，或以HRP標記的探針直接或間接結合膜上的核酸。洗膜后用MilliporeECL發(fā)光液A液和B液等體積的混合工作液，在可見(jiàn)光下室溫孵育膜數分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數秒到數分鐘至數小時(shí)。
MilliporeECL發(fā)光液哪些因素會(huì )影響熒光信號的強弱呢？
1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國產(chǎn)的保鮮膜，很多廠(chǎng)家偷工減料打價(jià)格戰，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應不充分，另一方面ECL所含液體會(huì )溶解試驗臺上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒(也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過(guò)某種化合物)、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡(jiǎn)述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過(guò)很多化合物、金屬離子能直接催化過(guò)氧化物水解，在極短的時(shí)間內消耗掉所有的HRP酶，熒光轉瞬即逝。
b.保鮮膜的化工原料或拉制過(guò)程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價(jià)的保鮮膜問(wèn)題尤多。
目前，國產(chǎn)的就“妙潔”比較過(guò)關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。
如果買(mǎi)不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結晶顆粒。
2.ECL孵育結束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過(guò)水會(huì )吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會(huì )干擾熒光強度，所以ECL孵育結束時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜*干掉。某些信號較弱的ECL，膜*干掉后熒光會(huì )消失；較好的試劑盒，熒光相對穩定，但*吸干以后，背景熒光也會(huì )升高，而且會(huì )嚴重影響重新標記新抗體時(shí)的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。
3.控干的膜要仔細用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現皺褶。皺褶的地方會(huì )堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線(xiàn)；要么由于液體吸收熒光或者局部區域HRP過(guò)度消耗，呈線(xiàn)條狀淬滅。
4.在膜放入壓片夾之前，好肉眼觀(guān)察一下熒光信號的強弱，這有利于判斷實(shí)驗可能出現的問(wèn)題。很多人提問(wèn)看見(jiàn)很強的熒光了，但怎么壓片都沒(méi)有信號，那么就是快速淬滅(閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號)造成的；有這個(gè)觀(guān)察至少能夠判斷ECL孵育之前實(shí)驗操作應該問(wèn)題不大，而問(wèn)題主要是淬滅。如果你省略這個(gè)步驟，那問(wèn)題就非常復雜了，因為之前任何操作都可能導致白板，根本無(wú)法判斷。
